輔酶 I NAD(H)測(cè)定試劑盒NAD + 的提取
（分光光度法，50T/24 樣）
一、 測(cè)定意義：
輔酶 I NAD(H) 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞
中，NAD + 是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要
氫受體，生成的 NADH 經(jīng)電子傳遞鏈（又稱呼吸鏈，ETC）
傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時(shí)，形成大量的活性
氧（ROS），同時(shí) NADH 再生為 NAD +。糖、脂、蛋白質(zhì)三
大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完
成。NAD(H)含量及 NADH/NAD +比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵
解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD +比值說(shuō)
明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外 NADH/NAD +
比值升高液可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán)。另外，NAD +降解產(chǎn)
物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作
用。
二、 測(cè)定原理：
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD + 和 NADH，NADH
通過 PMS 的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲?
（Formazan），在 570nm 下檢測(cè)吸光值；而 NAD + 可被乙
醇脫氫酶還原為 NADH，進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測(cè)。
三、 需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、1mL 比色皿、研
缽、冰和蒸餾水
五、 NAD + 和 NADH 提取：
1. 血清（漿）中 NAD + 和 NADH 的提取
NAD + 的提?。?/span>按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體
積（mL）為1：5-10 的比例（建議取約0.1mL 血清（漿），
加入1mL 酸性提取液），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；
冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新
的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，
10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADH 的提?。?/span>按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體
積（mL）為1：5-10 的比例（建議取約0.1mL 血清（漿），
加入1mL 堿性提取液），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；
冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新
的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，
10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2.
組織中 NAD + 和 NADH 的提取
NAD + 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）
為1：5-10 的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL 酸性提取
液），冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰
浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新的
離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，
10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADH 的提?。?/span>按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）
為1：5-10 的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL 堿性提取
液），冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰
浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新的
離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，
10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
3.
細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD + 和 NADH 的提取
NAD + 的提?。?/span>先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按
照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10 4 個(gè)）：酸性提取液體積（mL）為
500-1000：1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 酸
性提取液），超聲波破碎1min（冰浴，強(qiáng)度20％或200W，
超聲2s，停1s），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰
浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新的
離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，
10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADH 的提?。?/span>先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，
按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10 4 個(gè)）：堿性提取液體積（mL）為
500-1000：1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 堿
性提取液），超聲波破碎1min（冰浴，強(qiáng)度20％或200W，
超聲2s，停1s），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰
浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新的
離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，
10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
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